Diversidade genética em quiabeiro baseada em marcadores RAPD em feijão-de-vagem (página 2)

Foram avaliados cinco acessos de feijão-devagem (UENF 1429, UENF 1432, UENF 1442, UENF 1445 e UENF 1448) e suas 10 combinações híbridas F1, em esquema dialélico, sem inclusão de recíprocos.

Efetuaram-se quatro semeaduras para obtenção das progênies, sendo que as duas primeiras ocorreram em maio de 2001, com o período de cruzamentos tendo ocorrido entre junho e julho de 2001, totalizando 581 cruzamentos. As outras duas semeaduras foram realizadas nos meses de julho e agosto de 2001, sendo os cruzamentos efetuados entre setembro e outubro de 2001, perfazendo um total de 528 cruzamentos. Os acessos UENF 1429, UENF 1432, UENF 1442 e UENF 1445 participaram como doadores de pólen, e os acessos UENF 1432, UENF 1442, UENF 1445 e UENF 1448, como receptores.

Em todos os cultivos, o acesso UENF 1448, por ser precoce, foi semeado uma semana após os demais genitores. A semeadura estabelecida para avaliação do experimento foi realizada em julho de 2002, avaliando-se nove plantas de cada genitor e F1 em casa de vegetação, localizada na Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), em vasos plásticos com volume de 5,0 dm3 de substrato, contendo 40% de solo, 40% de esterco bovino e 20% de areia.

As seguintes características foram avaliadas: a) comprimento médio da vagem (CV), expresso em cm, obtido pela quantificação do comprimento longitudinal de uma amostra de 10 vagens por planta, de todas as plantas de cada tratamento, em relação ao número de repetições; b) diâmetro de vagem (DV), expresso em mm, obtido pela medição da seção transversal da vagem com auxílio de um paquímetro digital, em uma amostra de 10 vagens de todas as plantas de cada tratamento, em relação ao número de repetições; c) número médio de lóculos por vagem (NL), obtido pela contagem do número total de lóculos de cada vagem, em uma amostra de 10 vagens por planta; d) altura média da inserção da primeira vagem (APV), expressa em cm, obtida pela medição da distância do colo até a inserção da primeira vagem, de todas as plantas de cada tratamento, relativo ao número total de repetições do experimento; e) teor de fibra (TF), obtido a partir de 10 g de vagens "in natura", triturados por três minutos em liquidificador; em seguida, as amostras foram colocadas em peneiras de 30 "mesh" e lavadas em água corrente; posteriormente, as amostras foram lavadas com acetona (100%) e secas em estufa a 105ºC por cerca de uma hora, procedendo-se, em seguida, à pesagem do material (adaptado de Frank et al., 1961; Rodrigues, 1997; Rodrigues et al., 1998; Abreu, 2001); f) peso médio de vagens por planta (PMV), expresso em g, obtido pela relação entre o peso das vagens de todas as plantas de cada tratamento, em todos os blocos, e o número total de repetições; e g) número médio de vagens por planta (NMV), obtido pela razão entre o total de vagens, por tratamento, de todos os blocos em relação ao número de repetições.

Na análise estatística, identificados os pretensos híbridos que eram, de fato, autofecundações dos genitores, com base em marcadores RAPD, procedeuse à avaliação das características morfoagronômicas por meio da análise de variância de blocos inteiramente casualizados entre os genitores e entre genitores e híbridos, utilizando os recursos computacionais do Programa Genes (Cruz, 2001).

Foram utilizados os recursos computacionais do Programa Genes (Cruz, 2001) na análise das Variáveis Canônicas e para os procedimentos de Agrupamento pelo Método de Otimização de Tocher e Hierárquico do "Vizinho mais Próximo" (Cruz e Regazzi, 2001), com base na Distância Generalizada de Mahalanobis, a qual leva em consideração a matriz de variâncias e covariâncias residuais (Miranda et al., 1988).

Na identificação dos híbridos, empregou-se a análise por marcadores RAPD. Para tanto, procedeuse à extração do DNA genômico de cada genitor, conforme o método descrito por Doyle e Doyle (1990) e, em seguida, foram obtidos os "primers" selecionados para comprovação da hibridação nos indivíduos considerados F1.

Os microtubos foram dispostos em suportes e incubados em banho-maria a 65ºC por 40 minutos.

Durante a incubação, os tubos foram suavemente agitados a cada 10 minutos e, em seguida, foram resfriados à temperatura ambiente e centrifugados a 14.000 rpm por cinco minutos, transferindo-se o sobrenadante (cerca de 0,9 mL) para novos microtubos de 2,0 mL, já identificados. Após, foi efetuada a desproteinização, por meio da adição de 0,8 mL de clorofórmio-alcool isoamílico (24:1) a cada tubo, agitando-os suavemente por 10 minutos e promovendo uma nova centrifugação.

Novamente, o sobrenadante, cerca de 0,75 mL, foi transferido para novos tubos de 2,0 mL e adicionados 0,8 mL de clorofórmio-alcool isoamílico (24:1).

Procedeu-se a uma nova centrifugação. Após essa etapa, a fase superior, aproximadamente 0,6 mL, foi transferida para novos tubos de 1,5 mL, e adicionados 2/3 do volume de isopropanol gelado, promovendo a precipitação dos ácidos nucléicos. Os tubos foram invertidos suavemente, algumas vezes, e incubados a -20ºC por três horas. Após a incubação, os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 14.000 rpm, promovendo a formação de um precipitado branco no fundo de cada tubo. O sobrenadante foi, então, removido e o precipitado, lavado duas vezes com etanol a 70% e uma vez com etanol a 95%.

Em seguida, o material ficou exposto à temperatura ambiente por 20 minutos, para secar, sendo ressuspenso em 0,25 mL de tampão TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0), contendo RNAse na concentração final de 40 µg/mL. Após a ressuspensão, as amostras foram incubadas em banho-maria a 37ºC por 30 minutos e, em seguida, foi adicionado NaCl a 5 M, na proporção de 1:10 (NaCl : DNA ressuspenso), e adicionados 2/3 do volume de isopropanol gelado para precipitar o DNA novamente.

O material foi incubado em geladeira a 4ºC durante a noite. Posteriormente, as lavagens com etanol a 70% e a 95% foram repetidas e o precipitado final foi ressuspenso em 0,2 mL de TE, repousando durante quatro horas. Finalmente, o material foi quantificado com amostras de concentrações de 20, 40 e 80 ng/µl em gel de agarose, através da reflexão de luz ultravioleta sobre brometo de etídio.

OPAA01, OPAA02, OPAA03, OPAA04, OPAA05, OPAA06, OPAA07, OPAA08, OPAA09, OPAA10, OPAA11, OPAA12, OPAA13, OPAA14, OPAA15, OPAA16, OPAA17, OPAA18, OPAA19, OPAA20, OPAB01, OPAB02, OPAB03, OPAB04, OPAB05, OPAB06, OPAB07, OPAB08, OPAB09, OPAB10, OPAB11, OPAB12, OPAB13, OPAB14, OPAB15, OPAB16, OPAB17, OPAB18, OPAB19, OPAB20, OPAE01, OPAE02, OPAE03, OPAE04, OPAE05, OPAE06, OPAE07, OPAE08, OPAE09, OPAE10, OPAE11, OPAE12, OPAE13, OPAE14, OPAE15, OPAE16, OPAE17, OPAE18, OPAE19, OPAE20, OPAC01, OPAC02, OPAC03, OPAC04, OPAC05, OPAC06, OPAC07, OPAC08, OPAC09, OPAC10, OPAC11 e OPAC12.

Ao se obter os dados de presença e de ausência de bandas entre os genitores, por meio das imagens registradas em gel de agarose, obteve-se uma matriz de dados binários, pela atribuição de valor 1 à presença da banda gerada com a amplificação e valor 0 quando não se registrava a sua amplificação. A distância entre os pares dos genótipos foi calculada com base no Complemento Aritmético do Índice de Jaccard. Os procedimentos de Agrupamento pelo método de Otimização de Tocher e Hierárquico do "Vizinho mais Próximo" foram utilizados para confeccionar os agrupamentos dos genótipos (Cruz e Carneiro, 2003). Por fim, estimou-se a correlação de Pearson entre as distâncias genéticas com base no Complemento Aritmético do Índice de Jaccard e na Distância Generalizada de Mahalanobis, utilizando o programa GENES (Cruz, 2001).

Para as sete características avaliadas, a análise de variância registrou diferença significativa entre as médias dos cinco genótipos estudados, em 1% de probabilidade pelo teste F (Tabela 1), indicando haver variabilidade genética entre eles.

O coeficiente de variação experimental revelou valores inferiores a 21%, indicando pouca influência ambiental. Valores elevados de 47,4064% para APV e de 31,2105% para NMV, provavelmente estão vinculados às variações nas alturas de inserção da primeira vagem entre os genótipos, bem como a amplitude diferencial na produtividade de vagens.

Pela análise obtida entre os genitores e híbridos, também foi verificada diferença significativa entre as médias dos genótipos, em 1% de probabilidade pelo teste F (Tabela 2). Este fato ratifica a existência de diferenças genéticas não apenas entre os genótipos utilizados nos cruzamentos, mas também entre estes e os híbridos, indicando possibilidade de ganhos em futuros programas de melhoramento.

À semelhança do que ocorreu com o comportamento do coeficiente de variação na análise dos genitores (Tabela 1), a inclusão dos híbridos continuou evidenciando os maiores valores para APV e NMV (53,6712% e 38,7919%, respectivamente), denotando que houve uma tendência na manutenção da diferença de amplitude entre as inserções das primeiras vagens, bem como entre a produtividade de vagens entre genitores e híbridos.

Pela comparação entre pais e pais e híbridos, foi possível observar uma pequena redução de valores nas médias gerais das características CV, DV, APV e PMV.

Por outro lado, as características NL, TF e NMV apresentaram pequeno acréscimo em suas médias gerais.

Essa pequena variação entre os valores das médias gerais indica que a escolha correta dos genótipos a serem combinados em cruzamentos dialélicos podem favorecer a obtenção de um indivíduo superior com características agronômicas desejáveis.

A quantificação da divergência genética entre os cinco genitores, por meio das sete características morfoagronômicas (Tabela 3), revelou que os genótipos mais similares foram UENF 1442 e UENF 1445, por apresentarem a menor magnitude de distância, correspondente a 15,5151. Os genótipos UENF 1429 e UENF 1432 constituíram o segundo par mais semelhante, expresso pelo valor de igual a 17,8205. Por sua vez, os genótipos UENF 1432 e UENF 1442 foram os mais divergentes, revelando a maior magnitude de distância, ou seja, 217,9565.

Tais resultados denotam a existência de ‘pools gênicos’ entre os materiais avaliados que, em razão do tipo de vagem, se "Macarrão" ou "Manteiga", exibem comportamento dissimilar ou de proximidade gênica. Isso é ratificado pelo fato de o par mais próximo possuir vagens do tipo "Manteiga"; de o segundo par similar deter vagem do tipo "Macarrão"; ao passo que o par mais distante, UENF 1432 e UENF 1442 detém vagem do tipo "Macarrão" e "Manteiga", respectivamente.

Todavia há que se ressaltar que o segundo par mais distante (UENF 1442 e UENF 1448) possui vagem do mesmo tipo, qual seja, "Manteiga". Assim, a lógica da ocorrência de ‘pools gênicos’ com base no tipo de vagem deve ser analisada com certo ceticismo.Falconer (1987) recomenda cruzamentos entre genótipos mais contrastantes, uma vez que maior efeito heterótico é esperado em híbridos entre populações mais divergentes. Desse modo, os genótipos UENF 1432 e UENF 1442 seriam os mais indicados para tais cruzamentos.

Entretanto não se pode deixar de comentar a respeito da estreita base genética do feijão-de-vagem, por se tratar de uma espécie autógama. Portanto a necessidade de cruzamento entre diversos genótipos para obtenção de uma ampla gama de indivíduos é bastante conveniente. Isso posto, a utilização de combinações múltiplas a partir de cruzamentos dialélicos é uma alternativa viável para a ampliação da base genética da espécie e a obtenção de segregantes superiores.

Pelos resultados obtidos das distâncias de Mahalanobis entre genitores e híbridos (Tabela 4), verifica-se que os genótipos UENF 1442 e UENF 1448 foram os mais divergentes (199,6305).

Isso denota a inexistência de heterobeltiose, enquanto genitores mais divergentes (Tabela 3); não houve híbrido que os suplantassem com relação ao valor de distância genética, mantendo-se como os mais divergentes, mesmo na presença dos F1s. Assim, tais genótipos seriam indicados como os mais adequados para a obtenção de um indivíduo com expressivo efeito heterótico.

Os híbridos UENF 1448 x UENF 1442 e UENF 1448 x UENF 1445 apresentaram o menor valor de (1,0564), revelando elevada similaridade. Esse fato não era esperado, vez que UENF 1448 e UENF 1442 detiveram o segundo maior valor de (Tabela 3); e UENF 1445 e UENF 1448, a quarta magnitude de , conforme Tabela 3.

Pelo Método de Tocher (Tabela 5), utilizando-se apenas os genitores, houve a formação de três grupos.

Esse resultado revela que os genótipos com mesmo tipo de vagem se uniram em grupos; entretanto há presença de certa divergência genética entre os pais, posto que um dos genótipos com vagem tipo "Manteiga" ficou configurado em um grupo isolado.

O grupo I foi composto pelos genótipos UENF 1442 e UENF 1445, os quais apresentaram a menor magnitude de dissimilaridade, obtida pela Distância Generalizada de Mahalanobis (Tabela 3). O grupo II foi constituído pelo genótipo UENF 1429 e UENF 1432, enquanto o grupo III, formado apenas pelo genótipo UENF 1448, indica elevada divergência deste para com os demais, confirmando os valores elevados das suas distâncias nos pares em que participou (Tabela 3).

Com base no Método Hierárquico do "Vizinho mais Próximo" (Figura 1), com corte de 30%, depreende-se a formação dos mesmos grupos representados no método anterior, confirmando os resultados obtidos pelas distâncias de Mahalanobis (Tabela 3). O genótipo UENF 1448 foi caracterizado como o mais divergente em todos os métodos utilizados.

Tabela 4. Medidas de dissimilaridade entre 15 genótipos de feijão-de-vagem em relação a sete características, com base na Distância Generalizada de Mahalanobis ().

Pela análise do Método de Otimização de Tocher entre genitores e híbridos (Tabela 6), foi registrada a formação de cinco grupos, sendo que apenas um grupo revelou um único genótipo. Destaca-se que o grupo I foi configurado pela presença de quatro híbridos, todos tendo o genótipo UENF 1448 como receptor de pólen e os genitores restantes como doadores em cada combinação. O grupo II apresentou as combinações UENF 1442 x UENF 1429, UENF 1445 x UENF 1429, UENF 1442 x UENF 1432 e UENF 1445 x UENF 1432. Os genitores UENF 1429 e UENF 1432, juntamente com o híbrido formado pela sua combinação (1432 x UENF 1429) compuseram o grupo III. O híbrido UENF 1445 x UENF 1442 e os genitores UENF 1445 e UENF 1442, representaram o grupo IV, enquanto o genitor UENF 1448 ficou isolado dos demais, representando o grupo V.

Por meio de análise da Figura 2, obtida pelo Método Hierárquico do "Vizinho mais Próximo", entre genitores e híbridos, com corte de 30%, foi estabelecida a formação de cinco grupos, assim como observado no método de Tocher (Tabela 6), ocorrendo apenas a troca de ordem entre eles, sendo que os grupos II, IV e V de Tocher correspondem aos respectivos grupos IV, V e II do método do "Vizinho mais Próximo".

Tabela 5. Agrupamento pelo método de Tocher, de cinco genótipos de feijão-de-vagem, com base na Distância Generalizada de Mahalanobis ().

Apesar da concordância nos resultado das análises, Amaral Júnior (1996), referindo-se aos métodos de agrupamento utilizados, alerta para o modo subjetivo como são caracterizados os grupos nos métodos hierárquicos, relatando, ainda, que há maior confiabilidade nos métodos de otimização em relação aos hierárquicos, por proporcionar a formação de grupos independentes, não-relacionados.

As variâncias acumuladas pelas Variáveis Canônicas, demonstradas na Tabela 7, para as sete características avaliadas entre os cinco genitores, explicaram o acúmulo necessário de 80% da variação total nas duas primeiras Variáveis Canônicas, para permitir o estudo da divergência genética dos genitores, no espaço bidimensional (Figura 3).

Analisando a distribuição dos genótipos na Figura 3, nota-se a formação de três grupos, sendo que o acesso UENF 1448 apresentou-se como o único representante de um dos grupos, evidenciando a distância deste em relação aos demais. Os acessos UENF 1429 e UENF 1432 formaram outro grupo, com os acessos UENF 1442 e UENF 1445 compondo o terceiro.

Tabela 6. Agrupamento pelo Método de Tocher, de 15 genótipos de feijão-de-vagem, com base na Distância Generalizada de Mahalanobis ().

Esses resultados apresentaram completa identidade com os dados obtidos pelo agrupamento de Tocher (Tabela 5) e com o método Hierárquico do "Vizinho mais Próximo" (Figura 1).

Em relação à análise das Variáveis Canônicas, incluindo genitores e híbridos, percebe-se, pela Tabela 8, que as variâncias acumuladas para as sete características avaliadas explicaram o acúmulo necessário de 80% da variação total nas duas primeiras Variáveis Canônicas, dessa forma, permitiu-se o estudo da divergência genética entre eles em gráfico de dispersão bidimensional (Figura 4).

Tabela 8. Variâncias acumuladas (%) para Variáveis Canônicas das sete características avaliadas entre genitores e híbridos dialélicos.

Depreende-se, pela Figura 4, a formação de cinco grupos. Todos apresentam uma certa dissimilaridade, caracterizando a divergência existente entre eles. Há dois grupos com quatro genótipos cada, sendo que, em um deles, estão presentes os híbridos UENF 1448 x UENF 1429, UENF 1448 x UENF 1432, UENF 1448 x UENF 1442 e UENF 1448 x UENF 1445, ou seja, esse grupo é formado excepcionalmente por híbridos que contêm o genótipo UENF 1448 como receptor de pólen, e os demais genitores como doadores nos cruzamentos dialélicos. O outro grupo com quatro genótipos é representado pelos híbridos UENF 1442 x UENF 1429, UENF 1445 x UENF 1429, UENF 1442 x UENF 1432 e UENF 1445 x UENF 1432. Outros dois grupos estão representados por dois genitores e um híbrido cada, sendo que, em um deles, estão os genótipos UENF 1442, UENF 1445 e o híbrido obtido do cruzamento entre ambos, ou seja, UENF 1445 x UENF 1442. Os genótipos UENF 1429, UENF 1432 e seu híbrido, UENF 1432 x UENF 1429, completam os grupos representados por dois genitores e um híbrido. Por fim, encontra-se o único grupo com apenas um genótipo, UENF 1448.

Esses dados asseguram a eficiência do modelo, por agrupar genótipos com características bastante semelhantes, e proporcionar ao mesmo indivíduo receptor de pólen, ou ao híbrido resultante do cruzamento dos demais participantes, alocarem-se no mesmo grupo.

Para a análise conjunta entre genitores e híbridos, foi observada total coerência com os métodos de Tocher (Tabela 6) e com o "Vizinho mais Próximo" (Figura 2).

Identificados os "primers" polimórficos, foram selecionados aqueles que apresentavam as melhores "bandas" para distinção dos genitores, quais sejam: OPAA 11, OPAA 17, OPAE 04, OPAB 08, OPAC 01, OPAC 05, e OPAE 11.

Como exemplo, na Figura 5, o "primer" OPAA 17 apresentou polimorfismo entre o genitor UENF 1448 e os demais, possibilitando a identificação de todos os cruzamentos em que esse genitor participava. Pela mesma figura, observa-se que a combinação UENF 1448 X UENF 1442 apresentou ausência de fragmento em um dos indivíduos, caracterizando autofecundação do mesmo e hibridação dos demais. O mesmo princípio foi utilizado para confirmação de 139 indivíduos, em um total de 150. Para o estudo da diversidade genética entre os genitores, foram utilizados 72 "primers", que possibilitaram a obtenção de 264 marcas, sendo 88 polimórficas, utilizadas para a confecção de uma matriz de dados binários, a qual possibilitou gerar a matriz de dissimilaridade genética baseada no Complemento Aritmético do Índice de Jaccard (Cruz e Carneiro, 2003).

Na Tabela 9, encontram-se os dados obtidos pelo Complemento Aritmético do Índice de Jaccard para os cinco genitores. Verifica-se que os pais UENF 1429 e UENF 1432 foram os mais similares, por registrarem a menor distância (0,1528). De forma contrária, os genitores UENF 1445 e UENF 1448 foram os mais dissimilares, com valor de distância igual a 0,2040.

Esses resultados não são iguais aos obtidos com a Distância de Mahalanobis (Tabela 3); porém apresentam certa concordância no que diz respeito aos caracteres agronômicos da cultura. Pelo método de Mahalanobis, os genitores mais similares foram UENF 1442 e UENF 1445, ou seja, genótipos com vagens do tipo "Manteiga", e, por sua vez, o método realizado pelo Complemento Aritmético do Índice de Jaccard atribuiu similaridade aos genitores que apresentam vagem do tipo "Macarrão", identificados como UENF 1429 e UENF 1432, os quais também foram considerados, pelo método de Mahalanobis, com alta similaridade, constituindo o segundo par com menor valor de (Tabela 3). De forma análoga, apresentaram-se os genitores mais divergentes, sendo que um apresenta vagem tipo "Manteiga" e o outro, tipo "Macarrão", denotando que houve congruência entre as distâncias moleculares e o tipo de vagem dos genótipos.

O agrupamento obtido pelo Método de Tocher, realizado pelo Complemento Aritmético do Índice de Jaccard (Tabela 10), revelou a formação de três grupos, sendo o grupo I composto pelos genitores UENF 1429 e UENF 1432. Os genitores UENF 1442 e UENF 1448 formaram o grupo II. E, por fim, apresentou-se o grupo III com o genitor, UENF 1445.

Esses resultados foram, de certa forma, concordantes com o Método de Tocher (Tabela 5), no qual foram registrados três grupos, sendo que o grupo I foi correspondente ao grupo II presente na Tabela 5, diferenciando-se os grupos II e III, em que o genitor UENF 1445 assumiu um grupo isoladamente, trocando de posição com UENF 1448.

Pela análise de agrupamento utilizando o Método Hierárquico do "Vizinho mais Próximo", de acordo com o Complemento aritmético de Jaccard (Figura 6), foi possível estabelecer a formação de quatro grupos.

Visualiza-se um grupo com os genitores UENF 1429 e UENF 1432, sendo que os demais grupos apresentaram um único genitor cada, caracterizados pelos genótipos UENF 1445, UENF 1448 e UENF 1442, respectivamente. Em relação à Figura 1, na qual se avaliaram os agrupamentos por meio de características morfoagronômicas, houve certa relação, devido à concordância na detecção de um grupo composto pelos genitores UENF 1429 e UENF 1432, e de um grupo formado apenas pelo genitor UENF 1448. Entretanto, os demais genitores, UENF 1442 e UENF 1445 compartilharam o mesmo grupo.

Tabela 9. Medidas de Dissimilaridade entre cinco genótipos de feijão-de-vagem, com base no Complemento Aritmético do Índice de Jaccard.

Tabela 10. Agrupamento pelo Método de Tocher, de cinco genótipos de feijão-de-vagem, com base no Complemento Aritmético do Índice de Jaccard.

A presença de valor positivo e significativo nessa correlação permite argumentar que a avaliação molecular possibilita inferir a respeito da diversidade genética existente entre os genitores presentes neste trabalho. Também é possível argumentar que as características morfoagronômicas não apresentaram variação proeminente em relação ao que era esperado em nível molecular, ou seja, houve pouco efeito ambiental no comportamento dos genitores. Concluise, pois, que é possível, em nível molecular ou morfoagronômico, inferir a respeito da divergência genética dos cinco genitores utilizados neste trabalho.

ABREU, F.B. Aplicação de técnicas de análise multivariada em acessos de feijão-de-vagem (Phaseolus vulgaris L,) de crescimento indeterminado do banco de germoplasma da UENF. 2001. Tese (Mestrado) - Universidade Estadual do Norte Fluminense, Campos dos Goytacazes. 2001.

AMARAL JÚNIOR, A.T. Análise dialélica de betacaroteno, vitamina C, sólidos solúveis e produção e variabilidade em cultivares de tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill.) via marcadores RAPD. 1996. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 1996.

BARROS, L.M. Caracterização morfológica e enzimática do cajueiro (Anacardium occidentalle L.), tipos comum e anão precoce, por meio de técnicas multivariadas. 1991. Tese (Doutorado)-Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 1991.

CRUZ, C.D. Programa Genes: aplicativo computacional em genética e estatística. Viçosa: Editora UFV, 2001.

CRUZ, C.D.; CARNEIRO, P.C.S. Modelos biométricos aplicados ao melhoramento genético. v. 2. Viçosa: Editora UFV, 2003.

CRUZ, C.D.; REGAZZI, A.J. Modelos biométricos aplicados ao melhoramento genético. 2. ed. rev. Viçosa: Editora UFV, 2001.

DOYLE, J.J.; DOYLE, J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, Rockville, v. 12, p. 13-15, 1990.

FALCONER, D.S. Introdução à genética quantitativa. Tradução: SILVA. M. A.; SILVA. J. C. Viçosa: Imprensa Universitária. 1987.

FERREIRA, M.E; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 3. ed., Brasília: Embrapa-Cenargen. 1998.

FRANK, T. et al. Testing snap beans for fiber content. St. Louis: Keystone Seeds,. 1961.

GONZALES, S.N. Estudios de algunos factores que afectam el cruzamiento artificial em fijol común Phaseolus vulgaris L. de riego. Agricultura Técnica em México, México, v. 7, n. 2, p. 83-95, 1981.

MIRANDA, J.E.C. et al. Análise de trilha e divergência genética de cultivares e clones de batata-doce. Rev. Bras. Gen., Ribeirão Preto, v. 11, n. 4, p. 881-892, 1988.

RODRIGUES, R. Análise genética da resistência ao crestamento bacteriano comum e outras características agronômicas em Phaseolus vulgaris L. 1997. Tese (Doutorado)- Universidade Estadual do Norte Fluminense, Campos dos Goytacazes, 1997.

RODRIGUES, R. et al. Análise dialélica de seis características agronômicas em Phaseolus vulgaris L. Bragantia, Campinas, v. 57, n. 2, p. 241 – 250, 1998.

SING, S.P. et al. Genetic diversity in cultivated common bean – ll: marker based analysis of morphological and agronomic traits. Crop Sci., Madison, v. 31, p. 23-29, 1991.