Determinação por cromatografia gasosa de açúcares em frutíferas de clima temperado (página 2)

O cromatógrafo a gás utilizado foi um Shimadzu GC-14B, com coluna (Packed Column J. K.) de 3,2mm de diâmetro por 2m de comprimento, empacotada com silicone (SE-52 Uniport HP 80/100 mesh) e com detector de ionização de chama.

A temperatura do injetor foi de 200°C e velocidade do gás de arraste (nitrogênio) de 5mm/min. A temperatura inicial foi de 160°C, subindo a 250°C nos primeiros 18 minutos, finalizando aos 32 minutos.

O material vegetal utilizado para a determinação de açúcares solúveis foram gemas florais de pomáceas. Na preparação das amostras, as gemas foram coletadas, rapidamente congeladas em N líquido, armazenadas em ultrafreezer, posteriormente liofilizadas e moídas.

Para a extração dos açúcares, subamostras de 500 a 1.000 mg de tecido foram incubadas a 80-85 ºC, por 5 min, com 5mL de etanol a 80%, centrifugadas por 10min a 6.000 rpm e separadas do sobrenadante. O precipitado foi novamente centrifugado com 10ml de etanol 80%.

A partir da mistura dos dois sobrenadantes, foram determinados os açúcares solúveis. O precipitado foi armazenado para análises de amido.

Posteriormente, foi evaporado o sobrenadante a 45ºC, em rotavapor R-114, até não conter mais álcool. Após, transferido para um béquer e completado com aproximadamente 20ml de água deionizada.

Esses volumes foram primeiramente filtrados em colunas contendo a resina IR 120 (catiônica H⁺) para eliminar aminoácidos e, a seguir, em resina IR 400 (aniônica OH^-) para eliminar ácidos orgânicos.

No processo de filtragem por resinas, as amostras foram recebidas em balão volumétrico até completar o volume de 50ml, com água deionizada, adicionada superiormente à coluna. Nos 50ml eluídos de cada coluna, foram adicionados 5ml de ZnSO₄ 0,5N (5%) e 5ml de Ba(OH)₂ 0,33N (5%), para a precipitação e remoção das proteínas por decantação, e posterior filtração com papel filtro qualitativo.

Do filtrado, 20mL foram transferidos para um cadinho de porcelana e mantidos a 240-270ºC, até secar. Uma pequena quantidade foi passada para vidros de injeção, com adição de 1ml de pentaerythritol (1mg/ml, açúcar-padrão interno), e novamente submetido ao aquecimento (200°C), até a completa secagem, tendo-se o cuidado de não promover a queima dos açúcares. As amostras foram transferidas para um dessecador até serem utilizadas.

Na preparação para a injeção, as amostras foram submetidas ao aquecimento em chapa quente (200°C), em capela, com 1ml de pyridine, para solubilização, 200µl de hexamethyldisilazane (HMDS) e 100µl de trimethylchlorosilane (TMCS), para a metilação.

Após começar a emissão de bolhas, foram deixadas por aproximadamente 1 min, para a formação de um precipitado branco. Após resfriamento e decantação por 30 min, 2µl da amostra foi injetado no aparelho.

A concentração de cada açúcar (Fig.1) foi determinada por comparação à área correspondente ao açúcar-padrão interno (pentaerythritol), registrada pelo integrador. As concentrações foram ajustadas ao peso e ao volume de diluição de cada amostra, de acordo com a seguinte fórmula: [Ca]=(2,5[Cc] / M)1.000, onde [Ca] é a concentração do açúcar em mg.g^-1 MS, 2,5 o fator de diluição usado no preparo da amostra, [Cc] é a concentração do açúcar calculada pelo cromatógrafo, em mg, M a massa da mostra em mg e 1.000, o fator de correção.

Os resultados de açúcares solúveis, em gemas florais de pomáceas, são apresentados no cromatograma (Fig.1), onde estão registrados o número da amostra, o tempo de retenção de cada açúcar, a área e altura correspondentes ao pico de cada composto e a concentração do açúcar que foi utilizada na fórmula, para fins de cálculos.

De acordo com Ciola (1998), a cromatografia a gás tem enorme potencialidade devido à sua eficiência, facilidade, baixo custo e possibilidade de analisar misturas voláteis de alta complexidade, como: açúcares, gorduras, óleos essenciais, inseticidas residuais, etc.

Análises de açúcares solúveis também podem ser realizadas através da cromatografia líquida de alta performance (HPLC), obtendo-se alta precisão, porém especialistas da área de análise instrumental sabem que os custos das análises e do equipamento de cromatografia líquida são mais elevados em comparação à cromatografia gasosa. Portanto, a cromatografia gasosa, neste tipo de análise em tecido de frutíferas, é a mais indicada.

A metodologia descrita, através da cromatografia gasosa, mostrou-se adequada para análises de açúcares solúveis em tecidos de frutíferas, sendo técnica e economicamente viável.

Conclui-se que, através da cromatografia gasosa, obtêm-se eficiência e resolução cromatográfica, para análises de açúcares solúveis, sendo, desta forma, vantajoso e executável esse tipo de análise pelo método descrito.

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^IEng.Agrº Dr. Pesquisador RD/CNPq Embrapa Clima Temperado, Br 392, Km 78, Cx. Postal 403, 96001-970, Pelotas-RS

^IIEng.Agrº Dr. Pesquisador Embrapa Clima Temperado, Br 392, Km 78, Cx. Postal 403, 96001-970, Pelotas-RS
^IIIEng.Agrº MSc. Doutorando UFPEL/ FAEM, Dpto. Fitotecnia, Cx. Postal 354, CEP 96001-015, Pelotas-RS

^IVEng.Agrº Mestrando em Fruticultura, UFPel/FAEM Pelotas-RS

^VEng.Agrº MSc. Doutorando Universidade Federal de Lavras, Lavras-MG

^VIEng.Agrº Dra. Pesquisadora Embrapa Clima Temperado, Br 392, Km 78, Cx. Postal 403, 96001-970, Pelotas-RS

Artigo original: Rev. Bras. Frutic., Abr 2005, vol.27, no.1, p.173-174. ISSN 0100-2945