Atividade de peroxidase e polifenoloxidase na resistência do feijão à antracnose (página 2)

Este trabalho foi realizado na Embrapa Clima Temperado e na Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Foram avaliadas as cultivares de feijão (Phaseolus vulgaris L.) AB 136, Carioca, Macanudo e Rio Tibagi, no estádio de plântulas. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, do fatorial cultivares x tratamentos, em cinco repetições, com parcelas subdivididas. As análises de variância e os cálculos do coeficiente de correlação foram realizados segundo Zonta & Machado (1984).

As sementes foram semeadas em bandejas de plástico (55x40x15 cm) contendo areia esterilizada, e irrigadas com solução nutritiva completa (Smith et al., 1963). Nove dias após a germinação, realizou-se aspersão com atomizador manual, nas folhas, com as preparações de Colletotrichum lindemuthianum raça delta (fungo indutor na concentração de 1,4x10⁶ esporos por mL), ácido salicílico (0,01M) e água. Após três dias, realizaram-se coletas para as análises bioquímicas e em seguida as plantas foram aspergidas com o patótipo virulento de C. lindemuthianum, isolado 33/95, proveniente do Rio Grande do Sul, na concentração de 2,27x 10⁴ esporos por mL. Cinco dias após, realizaram-se novas coletas para as análises bioquímicas e avaliação da incidência da doença. A seguir, as plantas foram mantidas em condições ideais para o crescimento do fungo, ou seja, temperatura de 22±2ºC e umidade relativa de 95%, com iluminação mista de aproximadamente 195 µE s^-1 m^-2, por 14 horas. Na produção dos inóculos, foi utilizado o meio de Mathur et al. (1950).

Os tecidos foram pesados, rapidamente congelados em gelo seco e armazenados a 80ºC negativos, para análises posteriores. As folhas congeladas foram homogeneizadas à temperatura máxima de 4ºC em 10 mL de tampão fosfato 0,05 M (pH 7,0), contendo 1 mg de polivinilpirrolidona-10. O homogeneizado foi filtrado, centrifugado a 4.000 g por 20 minutos, sob refrigeração, e o precipitado foi descartado. O sobre-nadante foi conservado em gelo e usado nas determinações de peroxidase e polifenoloxidase.

A atividade da polifenoloxidase foi determinada de acordo com a técnica descrita por Hyodo & Yang (1971), com as modificações descritas a seguir. Em tubo gelado, foram colocados 3,6 mL de tampão fosfato 0,05 M, pH 6,0, 1mL do extrato enzimático, 0,1 mL de catecol 0,1 M, e a mistura foi agitada em vortex por 15 segundos. O tubo com a mistura foi incubado a 30ºC por 30 minutos e transferido para um banho de gelo. À mistura foi adicionado 0,2 mL de ácido perclórico a 1,4% e, após agitação em vortex, o tubo foi deixado em repouso por 10 minutos. A absorvância foi lida a 395 nm em espectrofotômetro. No controle, o extrato enzimático foi substituído por água. A atividade da enzima foi expressa em unidade enzimática (UE). Uma unidade da enzima foi definida como a quantidade de enzima que causou um aumento de 0,001 unidade de absorvância por minuto.

A atividade da peroxidase foi determinada de acordo com a técnica descrita por Matsuno & Uritani (1972), com as seguintes modificações. Em tubo gelado foram colocados 2,5 mL de tampão fosfato-citrato contendo solução de fosfato de sódio dibásico 0,2 M e ácido cítrico 0,1 M, pH 5,0, 1,5 mL de extrato enzimático e 0,25 mL de guaiacol 0,5%, sendo a mistura agitada em vortex durante 15 segundos. Em seguida, 0,25 mL de H₂O₂ 3% foi adicionado e a mistura novamente agitada em vortex. A mistura foi incubada a 30ºC por 15 minutos e transferida para um banho de gelo; à mistura foi adicionado 0,25 mL da solução de metabissulfito de sódio a 2%. Após agitação em vortex, a mistura foi deixada em repouso por 10 minutos. A absorvância foi lida a 450 nm, em espectrofotômetro. No controle, o extrato enzimático foi substituído por água. A atividade da enzima foi expressa em unidade enzimática (UE). Uma unidade da enzima foi definida como a quantidade de extrato enzimático que acusou um aumento na absorvância de 0,001 unidade por minuto. A concentração de proteína foi analisada pelo método de Lowry et al. (1951).

As isoperoxidases foram determinadas em amostras coletadas cinco dias após as inoculações com o patótipo virulento de C. lindemuthianum. Foi utilizada a eletroforese horizontal em gel de poliacrilamida 5% na avaliação das isoenzimas de peroxidase em folhas de feijão, no sistema descontínuo de tampões descrito por Scandalios (1969). Na preparação do extrato para as análises, utilizou-se uma parte da amostra e igual volume da mistura (1 parte do tampão lítio-borato 0,2 M, pH 8,3 e 9 partes do tampão tris-cítrico 0,2 M, pH 8,3), acrescida de 2-mercaptoetanol 0,15%. A migração eletroforética efetuou-se em câmara fria mantida a uma temperatura de 4ºC. A diferença de potencial foi mantida ao redor de 10 volts^-1 cm, fazendo-se migrar até que o fronte, formado pelos tampões e marcado pelo azul de bromofenol, atingisse 9 cm a partir do ponto de aplicação das amostras. O gel foi corado com guaiacol para visualização das isoenzimas de peroxidase.

Os compostos fenólicos foram extraídos da matéria seca das folhas, conforme Swain & Hillis (1959), e identificados segundo Folin Denis, citado pela Association of Official Analytical Chemists (1970) e Kosuge (1969).

Antes da inoculação do patótipo virulento, a atividade da polifenoloxidase foi maior nos tratamentos com ácido salicílico e C. Lindemuthianum, com significativos acréscimos, quando comparados com os resultados do controle, indicando uma indução na atividade destas enzimas (Tabela 1). Após a inoculação do patótipo virulento, a cultivar AB 136 não diferiu nos tratamentos com ácido salicílico, fungo indutor e patótipo virulento, apresentando rápida resposta ao ataque do fungo virulento. Esta cultivar, considerada resistente, apresentou maior atividade da enzima após indução aos três dias, em todos os tratamentos, seguida pela Macanudo. A cultivar Carioca, considerada suscetível, apresentou menor atividade de polifenoloxidase em todos os tratamentos, até mesmo no tratamento com água.

Quanto aos compostos fenólicos, as formas extraídas em metanol 100% e metanol 50% apresentaram maiores concentrações, exceto os teores em metanol 50% da cultivar Carioca (Tabela 2). Os teores de fenólicos extraíveis em água foram superiores nos tratamentos com ácido salicílico e C. lindemuthianum nas cultivares AB 136, Macanudo e Rio Tibagi. 

O maior acúmulo de compostos fenólicos ocorreu na cultivar AB 136, quando tratada com ácido salicílico e com o patótipo virulento (Tabela 2). Esta cultivar não apresentou nenhuma lesão. O acúmulo de compostos fenólicos variou de acordo com a cultivar. Estes dados são consistentes com as afirmações de Macheix et al. (1986), de que há uma distinção entre cultivares e estádios de desenvolvimento das plantas no acúmulo de compostos fenólicos e a resposta aos ferimentos. A ativação do metabolismo de fenóis após uma infecção, segundo esses autores, pode levar mais ou menos tempo, dependendo da formação de moléculas mais simples e de sua integração com estruturas químicas mais complexas, semelhantes a ligninas. Este fenômeno, de acordo com Bell (1981), pode ser interpretado como parte da indução de resistência de uma planta.

A análise da correlação entre atividade da polifenoloxidase e fenóis extraíveis em metanol 50% foi estatisticamente significativa (R = 0,7800), assim como a correlação entre fenóis extraíveis em água e atividade da polifenoloxidase (R = 0,9345) e da peroxidase (R = 0,9042), em todos os tratamentos. Estes resultados podem ser atribuídos à oxidação desses polímeros pela ação dessas enzimas, após o estímulo de indução da resistência pelo fungo indutor ou pelo ácido salicílico, sendo, com isto, dificultada a penetração do patógeno.

Os teores mais elevados de fenólicos extraíveis em metanol 50% podem ter sido conseqüência da ação da polifenoloxidase na hidroxilação de monofenóis e oxidação de difenóis. Segundo Wheatley (1982), a ação da polifenoloxidase processa-se por meio da hidroxilação de monofenóis para o-difenóis e oxidação destes o-difenóis para quinonas. Conforme Padmaja et al. (1982), os fenóis já presentes no ferimento de raízes de mandioca são oxidados para o-quinonas ou polímeros pela ação da polifenoloxidase, havendo estímulo à biossíntese de oxidação destes fenóis e conseqüentemente, um aumento da atividade desta enzima.

As quinonas presentes nos ferimentos têm ação antimicrobiana e os polímeros podem atuar como taninos, formando complexos com proteínas que atuam como barreira física na penetração de patógenos (Mueller & Beckman, 1974). Cardoso & Garraway (1977) demonstraram que as substâncias provenientes do material castanho da lesão de hipocótilos doentes de feijoeiros inibiam seletivamente isolados não-patogênicos ao feijoeiro. A cultivar AB 136, considerada como altamente resistente ao C. lindemuthianum, seguida pela cultivar Macanudo, apresentaram maior atividade de polifenoloxidase, enquanto a cultivar suscetível Carioca apresentou menor atividade desta enzima (Tabela 1). Agrios (1997) e Orober et al. (1999) também constataram que geralmente ocorre maior atividade da polifenoloxidase nos tecidos infectados de cultivares resistentes do que em tecidos infectados de cultivares suscetíveis ou em plantas sadias. A importância da atividade da polifenoloxidase na resistência a doenças, deve-se, provavelmente, à sua propriedade em oxidar compostos fenólicos para quinonas, os quais são muito mais tóxicos aos microrganismos do que o fenol original, e à sua ação protetora no local do ferimento.

Por esta razão, admite-se que um aumento na atividade da polifenoloxidase resulta em altas concentrações de produtos tóxicos de oxidação e, portanto, maior grau de resistência à infecção (Agrios, 1997; Zheng-Cuiming et al., 1999).

A atividade da peroxidase foi significativamente maior nas plantas tratadas com ácido salicílico e com o fungo indutor, antes e após a inoculação do patótipo virulento (Tabela 3). A cultivar AB 136 apresentou maior atividade desta enzima seguida pela Macanudo.

O estímulo na indução da atividade desta enzima, uma vez desencadeado pelo fungo indutor ou ácido salicílico, permaneceu após tratamento com o patótipo virulento. A cultivar Carioca, por ser suscetível, apresentava, aos cinco dias após a inoculação, grandes lesões provocadas pelo patótipo virulento. O metabolismo dos polifenóis, em determinadas situações, pode atuar como antioxidante e inativar o centro ativo de numerosas enzimas fenolases, incluindo a peroxidase (Piñol & Palazón, 1996). Por sua vez, a biossíntese de compostos secundários depende da constituição genética da planta, que determina a formação das enzimas de especialização correspondentes.

Marriott et al. (1978) constataram que aumentos na atividade da peroxidase, associados com ferimentos em vegetais, podem indicar aumento na biossíntese de lignina, que atua como uma barreira à infecção microbiana e também pode promover aumentos na concentração de produtos de oxidação de fenólicos, alterando a concentração de auxinas por causa da presença de AIA-oxidase. Birecka & Garraway (1978) também observaram aumentos na atividade da peroxidase em ferimentos ou tecidos infectados, perceptíveis 24 horas após o ferimento e continuando por muitos dias. Alguns trabalhos descrevem que o aumento na atividade da peroxidase é parte da fase geral de ativação do metabolismo, que sintetiza de novo esta enzima (Kanazawa et al., 1965; Fleuriet & Deloire, 1982). Esta reação ocorre rapidamente nas células infectadas, com estímulo do metabolismo das células vizinhas, organizando e estabelecendo um efetivo sistema de defesa pela planta em direção à área do ferimento. Em geral, as células mais próximas da área do ferimento são envolvidas (Fleuriet & Deloire, 1982). No entanto, a existência de um sinal sistêmico originado na zona de ferimento foi demonstrada por Walker-Simmons et al. (1984). Uma nova expressão do genoma também foi observada (Kahl, 1978), e estes novos transcriptomas (Souza et al., 2001) correspondem à síntese de novo de novas enzimas, incluindo peroxidase e várias outras enzimas do metabolismo de fenóis, aumentando, deste modo, o arsenal de proteoma.

Nos eletroferogramas dos extratos enzimáticos analisados para peroxidase, observa-se tanto nos tratamentos de indução de resistência, quanto no tratamento com o patótipo virulento, o aparecimento de uma nova banda protéica com atividade peroxidásica, perto da linha de frente do gel (Figura 1). Essa banda, que corresponde a uma isoperoxidase, não aparece nas plantas sadias ou sem estímulo de indução, nem nas análises de extratos enzimáticos das folhas da cultivar Carioca, considerada suscetível. Observa-se, também, a presença de bandas ativas na região anódica dos géis, em todas as cultivares, exceto na Carioca. Oliveira (1977) verificou o aparecimento de bandas nas regiões mais anódicas dos géis, em folhas secundárias infectadas da cultivar Cuva 168N, e atribuiu este fato à necrobiose dos tecidos infectados pelo fungo causador da ferrugem; em tecidos suscetíveis da cultivar Mulatinho, verificou a redução da atividade destas bandas. 

Provavelmente esta isoperoxidase é sintetizada em mínimas quantidades, e, com o estímulo de indutores, ou pelo próprio fungo virulento, passa a ser sintetizada de novo, nas cultivares que possuem este metabolismo de resistência mais ativo, uma vez que não foi detectada na cultivar Carioca. Resultados semelhantes foram observados quanto ao aparecimento de novas isoenzimas de peroxidase (Birecka et al., 1973; Fleuriet & Deloire, 1982) e síntese de novo de formas preexistentes após ferimentos (Shannon et al., 1971). Em tomate, uma das isoenzimas de peroxidase, cuja atividade aumenta consideravelmente após um ferimento, está envolvida na possível cura do ferimento no fruto (Fleuriet & Deloire, 1982). O fato é que tanto o fungo indutor quanto o ácido salicílico induziram a resistência das plantas com respostas semelhantes, indicando assim que, provavelmente, o mesmo metabolismo de indução de resistência possa ocorrer.

O fungo indutor e o ácido salicílico induzem a resistência das plantas à antracnose, produzindo respostas semelhantes.

À Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas-Botânica da UFRGS, por possibilitar a realização deste trabalho.

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